¿Cómo y por qué purificamos las proteínas?

¿Cómo y por qué purificamos las proteínas?

¿Cómo y por qué purificamos las proteínas?

greg russ

persiguiendo el brillo

Ver más historias

Para la mayoría de las personas, «proteína» es solo una línea en una etiqueta de información nutricional. Pero muchos de los medicamentos desarrollados a través de la biotecnología moderna (insulina humana, vacunas, tratamientos contra el cáncer, etc.) – están enteramente basados ​​en proteínas.

La proteína enumerada en la información nutricional suele ser una colección grande y compleja de cientos o miles de moléculas separadas. Cada proteína en el músculo de pollo y las células grasas, por ejemplo, se encuentra indudablemente en los «miles» del espectro, y eso es antes de que consideremos cosas como variantes empalmadas y modificaciones químicas comunes de las proteínas. Por el contrario, los medicamentos deben ser una sola proteína, en gran parte libre de contaminantes que puedan causar reacciones alérgicas u otros efectos no deseados. ¿Cómo se pasa de mil a uno?

Dado que cada proteína es químicamente distinta, su aislamiento aprovecha su química distintiva. Décadas de investigación bioquímica nos han dejado varias formas de usar esta química para separar una proteína de una masa de otras. Después de todo, los bioquímicos necesitan aislar proteínas puras para estudiar sus actividades y estructura, a veces para la investigación básica y, a veces, en el camino hacia el desarrollo de fármacos. Afortunadamente, sus métodos se han adaptado a la producción industrial.

Sostenida por columnas

Es relativamente fácil extraer una mezcla de proteínas de las células; simplemente explotas las celdas. Los detergentes actúan para abrir orificios en las membranas, lo que permite que se derrame el contenido de las células. Luego, los desechos de la célula (membranas y ADN) se pueden eliminar girando la mezcla resultante en una centrífuga, que arrastrará hacia abajo los desechos más pesados. (Si realmente desea purificar una proteína de membrana, que tiende a no disolverse en agua, generalmente debe volver a disolver los desechos y realizar la mayor parte de la purificación posterior en otros solventes).

Para algunas proteínas más grandes o complejos de proteínas, es posible usar el paso de centrifugación para purificarlos parcialmente. Es posible mezclar una solución de una sustancia pesada, que formará un gradiente de densidad en el tubo de centrífuga (de abajo hacia arriba, de arriba hacia abajo). Dado que las proteínas grandes tienen una densidad bien definida, se asientan en una ubicación vertical específica a lo largo del gradiente. Pero muchas proteínas que nos interesan, como la insulina, son demasiado pequeñas para que esto funcione.

Después de eso, pasa por una serie de pasos diseñados para hacer que su proteína se adhiera a las cosas, a diferencia de la mayoría de las otras proteínas. Por lo general, también habrá algunas proteínas problemáticas que se adhieren, por lo que a menudo debe realizar varios de estos pasos de adherencia en serie, cada uno de los cuales elimina más proteínas no deseadas cada vez.

Publicidad

Estos pasos se realizan en las llamadas «columnas»: tubos de vidrio llenos de un material (generalmente perlas o gel). Estos permiten que las soluciones pasen mientras retienen un subconjunto de proteínas. Generalmente hay dos tipos de columnas. En uno, que llamaré una «columna pegajosa», su proteína se pega firmemente y permanecerá allí mientras la mayoría de las otras proteínas pasan. En la otra, que llamaré «columna lenta», las proteínas se mueven a diferentes velocidades. Solo tienes que determinar cuándo el tuyo sale por el otro extremo.

Este gran objeto blanco adjunto a la derecha de la máquina es una columna típica.  Una fuente de la solución que fluye a través del sistema es la botella superior.Agrandar / Este gran objeto blanco adjunto a la derecha de la máquina es una columna típica. Una fuente de la solución que fluye a través del sistema es la botella superior.

greg russ

Para una columna lenta, la mezcla de proteínas comienza en la parte superior de la columna, luego las propiedades físicas de la proteína (su tamaño y complejidad) la ralentizan a medida que la solución fluye por la columna. por ejemplo, un columna de filtración de gel Consiste en una malla gruesa de fibras microscópicas por las que deben pasar las proteínas a medida que el flujo de líquido a través de la columna las lleva hacia abajo.

Alternativamente, un columna de exclusión de tamaño contiene perlas con muchos poros diminutos con tamaño definido. Las proteínas lo suficientemente pequeñas pueden difundirse en los poros y, por lo tanto, viajar lentamente. Las proteínas por encima del umbral de tamaño, por otro lado, no pueden penetrar en los poros y drenar rápidamente.

Para que las columnas lentas funcionen, el solvente se vierte continuamente sobre la parte superior de la columna, provocando un flujo descendente. Dependiendo de la fuerza con la que se reduzca la velocidad de la proteína de interés, saldrá del fondo algún tiempo después. Sin embargo, no es particularmente preciso, ya que la proteína se mueve a una velocidad media. Si grafica la producción de proteínas de la columna contra el tiempo, termina con una curva gaussiana (campana). Entonces, recolecta la solución durante un período de tiempo que captura la mayor parte del período cuando hay mucha proteína.

Aquí, el eje Y registra la cantidad de proteína presente, mientras que la X representa el tiempo.  Con el tiempo, el líquido sale de la columna a un ritmo constante, por lo que cada intervalo numerado representa un solo mililitro de disolvente que sale.  Al guardar las fracciones 7-10, puede obtener la gran mayoría de su proteína.Agrandar / Aquí, el eje Y registra la cantidad de proteína presente, mientras que la X representa el tiempo. Con el tiempo, el líquido sale de la columna a un ritmo constante, por lo que cada intervalo numerado representa un solo mililitro de disolvente que sale. Al guardar las fracciones 7-10, puede obtener la gran mayoría de su proteína.

Juan Timmer

Las columnas pegajosas funcionan de manera un poco diferente. Aquí su proteína entra por la parte superior y luego se adhiere al material en la columna. Básicamente, puede ejecutar cantidades infinitas de solvente a través de la columna para deshacerse de cualquier suciedad que venga con la proteína, lo que limpia las cosas considerablemente. Y, una vez que está limpio, agrega una solución diferente en la parte superior, una solución que interrumpe la interacción entre su proteína y la columna pegajosa. Nuevamente, su proteína se escurrirá por el fondo (nuevamente mostrando un patrón en forma de campana con el tiempo).

Una opción para una columna pegajosa se basa en la carga. La mayoría de las proteínas contienen aminoácidos que pueden cargarse según el pH de la solución en la que se encuentran al ganar o perder un ion de hidrógeno. Entonces, al ajustar cuidadosamente el pH de una solución, puede asegurarse de que su proteína tenga carga positiva o negativa. Luego, la mezcla de proteínas se puede ejecutar en un columna de intercambio iónico. Aquí, los materiales de la columna tienen una superficie cargada que es neutralizada por la presencia de iones (cloro o magnesio, por ejemplo). Cuando aparece una proteína de carga opuesta, puede desplazar los iones y adherirse a la superficie en su lugar. Esencialmente, estás intercambiando iones por una proteína cargada.

Publicidad

La proteína se adherirá a ella a medida que pasen otras, y permanecerá adherida hasta que cambie el pH, momento en el cual los iones se pueden volver a intercambiar.

Una atracción similar se utiliza para cromatografía de fase inversa, excepto que aquí la atracción es hidrofóbica (aversión al agua). Un alto contenido de sal hace que las áreas hidrofóbicas de la proteína se adhieran a la superficie hidrofóbica de la columna. La proteína se une hasta que un solvente más hidrofóbico, generalmente una mezcla de agua y alcohol, pasa a través de la columna.

En algunos casos, es posible obtener interacciones muy específicas. Por ejemplo, si se sabe que dos proteínas interactúan y puede pegar una en la superficie de una columna, puede pegar la segunda en la columna hasta que cambie el pH y agregue sal. Este enfoque se llama Cromatografía de afinidad, y ni siquiera necesita dos proteínas para interactuar. Es posible pescar proteínas de unión al ADN cubriendo una columna con la secuencia de ADN que reconocen.

Un caso especial involucra el uso de anticuerpos. Si puede producir un anticuerpo contra su proteína, simplemente puede cubrir la superficie de la columna con el anticuerpo: su proteína permanecerá bloqueada. También es posible modificar genéticamente el gen que codifica su proteína para agregar una «etiqueta», una secuencia corta de aminoácidos que reconoce un anticuerpo. Esto le permite purificar la proteína incluso si no tiene anticuerpos contra ella. (Esto es más importante de lo que parece, porque por lo general tienes que purificar una proteína para producir anticuerpos, creando un catch-22). Si la etiqueta no cambia la proteína, se puede dejar en su lugar. Alternativamente, también puede modificar los genes para agregar una secuencia que una enzima reconozca y corte, eliminando la etiqueta después de la purificación.

Un último enfoque implica afinidad con los metales. Ciertos aminoácidos tienen afinidad por ciertos metales. Si tiene alguno en la superficie de la proteína, se adherirá a una columna recubierta con el metal apropiado. Una de las interacciones más fuertes es entre la histidina, un aminoácido, y el zinc metálico. De la misma manera que puedes crear un gen para que contenga una etiqueta, es posible agregar una secuencia de seis histidinas al final de una proteína. Luego, su proteína se adherirá hasta que se agregue otro químico similar al zinc a la columna.

Como se mencionó anteriormente, a menos que haya determinado una afinidad específica, generalmente obtendrá una cantidad de proteínas adicionales saliendo de la columna junto con su proteína de interés. En consecuencia, varias de estas técnicas se utilizan a menudo en serie para obtener una proteína lo suficientemente pura como para ser estudiada.

Lo notable, sin embargo, es que estas técnicas están evolucionando. Si bien los investigadores pueden purificar nanogramos de proteína en columnas de unos pocos centímetros de largo, es posible fabricar columnas enormes para producir proteínas a escala industrial. Se aplican todos los mismos principios, y es posible que el mismo procedimiento utilizado en el laboratorio se pueda utilizar en una instalación de producción.

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada.